Диагностика

Этапность диагностики наследственных болезней обмена веществ.

Ряд свойств наследственных болезней обмена (НБО) – генетическая гетерогенность, клинический полиморфизм, наличие гено- и фенокопий – чрезвычайно затрудняют их клиническую диагностику. Тогда как биохимический характер повреждения позволяет наиболее точно и достоверно охарактеризовать дефект на молекулярном уровне, причем биохимические параметры при НБО имеют тенденцию в десятки и даже сотни раз отличаться от нормальных. Существенно также, что изменения в биохимических параметрах по срокам своего появления предшествуют и, иногда значительно, возникновению клинических симптомов. Более того, если клинические проявления дефекта могут быть купированы специфическим терапевтическим вмешательством, то эффективность последнего зависит от срока, в который оно начато.

Все эти факторы наряду с низкой частотой распространения большинства НБО в популяциях определили применение специфического подхода к диагностике НБО, именуемого просеиванием (скринингом). По определению ВОЗ, просеивание  - это предположительное выявление не диагностированной ранее болезни или дефекта с помощью тестов, обследований или других процедур, дающих быстрый ответ.

Процедура просеивания в силу слепого подхода и отчасти несовершенства некоторых просеивающих методов не обеспечивает окончательного диагноза, а лишь выявляет предположительных больных или носителей, которым необходимы повторное обследование и подтверждение диагноза. По мере усовершенствования методов различия в точности и специфичности между «просеивающим» и «подтверждающим» методами могут стираться, но необходимость в повторном обследовании предположительно выявленного больного остается.

Структуры просеивающих программ сильно варьируют от целей, а также возможностей органов здравоохранения. Принципиальным является деление просеивающих программ на массовые, когда объектом просеивания является видимо здоровая популяция, и селективные, когда объектом просеивания являются определенные контингенты больных, среди которых ожидается накопление искомого заболевания.

Программы массового просеивания.

Основная цель программ массового просеивания на НБО – выявление заболевания в доклинической стадии, когда оно еще курабельно, либо выявление здоровых носителей до рождения у них потомства, когда имеется возможность методами пренатальной диагностики установить наличие заболевания у плода и в случае необходимости прервать беременность.

Таким образом, исходя из направленности скрининга, он может быть:

неонатальным (обследование новорожденных на ФКУ, врожденный гипотиреоз и др.);

пренатальным (обследование беременных на наличие дефектов нервной трубки и хромосомных болезней у плода);

ювенильным (выявление гетерозиготных носителей некоторых некурабельных летальных и сублетальных НБО, распространенных с высокой частотой в ряде популяций, таких как б-нь Тея-Сакса среди евреев-ашкенази или гемоглобинопатии в популяциях, подвергшихся действию малярийного фактора отбора).

Поскольку программы массового скрининга учреждаются в рамках государственного или регионального здравоохранения, они должны отвечать следующим требованиям:

обеспечение принципиальных преимуществ больному и его семье в плане выживаемости, здоровья, благополучия физических, социальных и психологических функций;

обеспечение экономической выгоды для общества, т.е. стоимость программы не должна превышать стоимости содержания обществом не выявленных и не леченных больных или стоимости всех других методов борьбы с данным заболеванием.

Методы, используемые в программах массового просеивания, включают как специально разработанные, так и ранее известные, но адаптированные для целей просеивания.

Скрининг новорожденных на метаболические заболевания существует уже 37 лет. Все началось в1962 г, когда Роберт Маккриди, директор Диагностической лаборатории в отделе здравоохранения штата Массачусеттс, США, совместно с Робертом Гатри , основателем скрининга новорожденных, организовали сбор бланков из фильтровальной бумаги с сухими пятнами крови (dry spots) от каждого новорожденного в штате Массачусеттс, и тестировали их на фенилкетонурию (ФКУ), используя разработанный Гатри бактериальный метод исследования фенилаланина (Фен). В конце 1960-х гг, рутинное тестирование новорожденных на ФКУ было распространено почти на все штаты и некоторые страны Европы. В рамках многих программ было начато тестирование и на другие наследственные дефекты, такие как галактоземия, болезнь с запахом кленового сиропа, гомоцистинурия. В середине 1970-х гг к образцам крови по Гатри были адаптированы радиоиммунологический метод исследования тироксина (Т4) для диагностики врожденного гипотиреоза, а в настоящее время - исследование 17-гидроксипрогестерона для диагностики врожденной гиперплазии надпочечников, ферментативный анализ для определения дефицита биотинидазы и др.

Новая эра в неонатальном скрининге была открыта с появлением тандемной масс-спектрометрии (ТМС), технологии, существенно улучшающей скрининг и расширяющей список скринируемых нарушений, поддающихся лечению и ранее не диагностируемых скрининг-программами. Применение ТМС позволяет выявлять одновременно в одном образце крови не менее 20 заболеваний. Эта технология позволила выявлять, в частности, у новорожденных недостаточность среднецепочечной ацил-КоА-дегидрогеназы. Без ранней диагностики и лечения дефект приводит к приступам гипогликемии, судорогам и коме, которые могут возникать в состоянии натощак при удлинении интервалов между кормлениями. В первые годы жизни риск смерти в такой ситуации составляет 20%. Ранняя диагностика позволяет информировать семью о недопустимости возникновения гипогликемии, необходимости ритмичности питания, сбалансирования диеты и т.д.

Применение ТМС для целей популяционного скрининга расширяет его диагностические возможности, ставя при этом ряд новых задач, поскольку для многих заболеваний, выявляемых этим методом, эффективное лечение в настоящее время отсутствует. Существенно, что рано поставленный диагноз избавляет семью от долгих и трудных диагностических процедур в будущем. Семья оказывается в сфере медико-генетической помощи с возможностью пренатальной диагностики при последующих беременностях. Ранняя диагностика таких состояний, возможно, явится стимулом для разработки лечения этих болезней.

Далее возможность исследования ДНК в образцах крови по Гатри дало возможность молекулярного скрининга. Скрининг широко распространился в мире, но единая программа для всей страны была принята только в Японии.Образцы крови по Гатри и Сузи получают из пятки, вены, венозных и артериальных катетеров, при этом уровень метаболитов меняется мало.

Практическое значение программ массового просеивания для новорожденных состоит в своевременном выявлении и назначении лечения больным, что возвращает семье и обществу полноценных (фенотипически) членов, ранее обреченных на инвалидность. Отягощенная семья получает медико-генетическую консультацию, и информация о таких семьях  закладывается в генетические регистры, так что просеивающие программы служат не только ныне живущим, но и будущим поколениям.

Программы селективного просеивания.

Использование программ селективного просеивания на НБО в практике здравоохранения необходимо для решения двух задач:

- определение спектра и удельного веса отдельных НБО в популяции;

- диагностика имеющихся в популяции НБО, которые не охватываются массовым скринингом либо из-за его отсутствия, либо по возрасту.

Первая задача имеет прямое отношение к организации программ массового просеивания, учреждение которых требует выяснения примерной частоты  в популяции и определения чувствительности и специфичности избранного метода в условиях массового обследования.

Решение этих задач в практике селективного просеивания достигается путем разовых обследований двух контингентов с ожидаемым накоплением НБО:

1). контингентов больных повышенного риска

2). выборок популяций.

Обследуемые контингенты в программах селективного просеивания таким образом представляют собой сегменты популяции, вычлененные на основании клинических, этнических или географических критериев. С одной стороны, это умственно отсталые, сосредоточенные в домах инвалидов и спецшколах, хронические больные нефрологических, гематологических, ортопедических и др. отделений в клиниках. С другой стороны – это выборки из популяций в странах с ожидаемым накоплением отдельных НБО (гемоглобинопатии, б-нь Тея-Сакса).

Контингент умственно отсталых больных отягощен НБО, среди которых превалируют аминоацидопатии, галактоземия, органические ацидурии, дефекты пуринового обмена, лизосомные болезни. Просеивание на НБО в определенном контингенте противоречит принципу безотборности, поэтому нужно с большой осторожностью подходить к трактовке результатов селективного просеивания. Однако в ряде случаев оно является незаменимым. Так, например, для установления целесообразности учреждения массового просеивания на ФКУ в ряде популяций было проведено селективное просеивание контингента интернированных умственно отсталых на это заболевание.

Трудности клинической диагностики НБО обуславливают применение просеивающего подхода по самым широким показаниям. Широкий спектр показаний к просеиванию, исключающий только явно экзогенную патологию, делает выборочное просеивание неотъемлемой рутинной процедурой современной диагностики метаболических заболеваний.

Диагностические возможности программы селективного скрининга, использующейся сегодня в медицинской практике, включают выявление НБО аминокислот, углеводов, органических кислот и т.д. В данную программу не включены диагностические тесты на муковисцидоз и врожденный гипотиреоз – два часто встречающихся НБО. Методы их биохимической диагностики не вписываются в структуру скринирующей программы (различие в материале для исследования и методических подходах).

Выборочным просеиванием выявляется основная масса НБО в популяции, поскольку массовое просеивание выявляет ограниченное количество нозологических форм.

Подтверждение диагноза.

Просеивающие программы обеспечивают только предположительное выявление больных НБО и требуют обязательного подтверждения диагноза.

Стратегия подтверждающей диагностики включает:

- вычленение поврежденного мутацией метаболического пути через количественную характеристику метаболитов и исследование кинетики их накопления;

- вычленение мутантного белка через оценку количества или активности белков, контролирующих данную метаболическую цепь;

- выяснение природы мутации.

Такая стратегия необходима отнюдь не для решения сугубо теоретических проблем (характеристика нормального метаболизма, структурной организации генома, изучение генетического груза популяции), она необходима и для практической диагностики НБО. Так, постнатальная диагностика ФКУ возможна на уровне патологических метаболитов, однако дифференциация форм этого заболевания на этом уровне невозможна. А именно от формы ФКУ зависит тактика врача при назначении диетотерапии. Ведь неклассическая ФКУ требует совсем другого подхода к лечению этого заболевания.

Методы подтверждающей диагностики НБО могут быть классифицированы по фенотипическим уровням их проявления:

-исследование на уровне метаболитов в биологических жидкостях или клетках;

-  исследования мутантных белков (чаще всего ферментов);

- исследование мутантных генов.

Анализ на уровне метаболитов включает следующие методические подходы:

· количественная оценка метаболитов в биологических жидкостях и клетках;

· исследование кинетики накопления и выведения метаболитов in vivo и in vitro;

· анализ ростовых характеристик мутантных клеточных штаммов на минимальных, селективных и полноценных средах.

Количественная оценка метаболитов осуществляется многими методами:

· спектрофотометрия;

· флюорометрия;

· пламенная спектрофотометрия

· высокоэффективная жидкостная хроматография;

· газожидкостная хроматография.

С помощью этих методов выявляются и имеют диагностическую значимость повышенные концентрации нормальных и патологических метаболитов в биологических жидкостях. Снижение концентрации метаболитов имеет меньшую диагностическую значимость, поскольку может иметь вторичный характер или выявляться при множестве НБО благодаря взаимодействию метаболических путей.

Большие возможности для анализа измененных мутацией метаболических путей дает использование культивируемых клеток. Так, для диагностики многих болезней накопления используется культура кожных фибробластов (исследуют накопление радиоактивно меченых  метаболитов). Кроме того, диагностика многих НБО возможна путем выращивания культуры клеток на селективных средах (дифференциальная диагностика между витамин зависимыми и витамин независимыми формами гомоцистинурии путем выращивания ККФ больного на средах, содержащих различные концентрации пиридоксаль-5-фосфата).

Исследование мутантных белков в биологических жидкостях и клетках имеет своей целью локусную и аллельную дифференциацию НБО и осуществляется с помощью прямого и непрямого подхода.

Прямой подход включает измерение концентрации, активности, кинетических и физико-химических параметров мутантного белка.

Измерение концентрации белка осуществляется с помощью иммунохимических методов во всех их разновидностях, обязательным компонентом которых является выделение высокоочищенного белка и получение к нему антител. Наибольшее распространение в настоящее время получили уже рассмотренные нами иммуноферментные и иммунофлюоресцентные методы, а также различные методы электрофореза. В связи с тем, что для этого необходим очищенный белок, перечисленные методы нашли применение для диагностики НБО, связанных с дефектами циркулирующих белков (гемоглобинопатии, дефицит a1-антитрипсина и др.).

В диагностике энзимопатий главная роль принадлежит определению активности фермента и исследованию его физико-химических и кинетических параметров( электрофоретической подвижности, термостабильности, оптимуме рН и др.).

Непрямой подход к локусной и аллельной дифференциации НБО на уровне мутантного белка включает нагрузочные тесты, метаболическое кооперирование, гибридизацию соматических клеток. Так, первые симптомы при некоторых формах сфинголипидозов могут быть выявлены в первые года жизни и привести к постановке диагноза. Однако возникает вопрос прогноза заболевания. А для этого необходимо охарактеризовать функциональные возможности остаточной ферментной активности. Для этой цели могут быть использованы нагрузочные тесты естественным меченым субстратом. Так, эффективность гидролиза меченого цереброзидсульфата культурами фибробластов больных с разными клиническими формами метахроматической лейкодистрофии соответствует тяжести заболевания.

Метод гибридизации соматических клеток применяется для локусной дифференциации дефектов, характеризующихся снижением активности одного и того же фермента (b-галактозидаза – муколипидоз I, генерализованный ганглиозидоз, МПС IVB) или разных изозимов одного фермента (гексозаминидазы А и В). отсутствие комплементации при гибридизации клеточных штаммов больных свидетельствует о монолокусности дефектов, наличие комплементации – о полилокусности.

Методы подтверждающей диагностики включают широкий арсенал самых современных биохимических методов, которые достаточно сложны и дорогостоящи. Поэтому практически невозможно охватить диагностику всех НБО в одном клиническом учреждении. Для преодоления этих трудностей все шире используется профилизация центров. Больные (или их биологический материал) с предположительным диагнозом, поставленным на основании просеивающего теста или клинической картины, посылаются в специализированные лаборатории или центры. Это обеспечивает достоверность диагноза и экономичность, оправдывая разработку дорогостоящих методов для редких НБО.

Частоты ФКУ по данным массового просеивания.

Страна

Число обследованных

Частота

 

Белорусь

Литва

Москва

 

Северная Ирландия

 

Германия

 

Дания

 

Чехия

 

Шотландия

 

Польша

 

Италия

 

Австралия

 

Австрия

 

Египет

 

Англия

 

Франция

 

США

 

Норвегия

 

Израиль

 

Канада

 

Греция

 

Швейцария

 

Швеция

 

Мексика

 

Япония

 

Финляндия

 

 

888 516

 

 

 

287 453

 

6 268 501

 

587 795

 

1 218 225

 

927 555

 

1 979 000

 

395 500

 

2 334 679

 

1 003 841

 

12 904

 

2 918 420

 

3 324 768

 

11 662 680

 

150 000

 

830 769

 

1 300 000

 

240 000

 

988 608

 

1 138 142

 

45 610

 

2 544 898

 

71 135

 

1:5 963

1:11 786

1:6 500

 

1:4 563

 

1:6 697

 

1:7 734

 

1:8 122

 

1:8 356

 

1:9 248

 

1:10 986

 

1:11 224

 

1:12 242

 

1:12 904

 

1:14 306

 

1:15 044

 

1:15 069

 

1:16 667

 

1:16 815

 

1:18 310

 

1:18 462

 

1:19 384

 

1:30 761

 

1:45 610

 

1:65 254

 

1:71 135

 

Интересная статья? Поделись ей с другими: